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細(xì)胞學(xué)堂 | 如何解決bEnd.3細(xì)胞形態(tài)變化、難消化

更新時間:2023-05-23  |  點擊率:1323

bEnd.3 [BEND3] (小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞)是從來自患有內(nèi)皮瘤的小鼠腦組織中分離的內(nèi)皮細(xì)胞,該細(xì)胞通過表達(dá)多瘤病毒中間T抗原的NTKmT逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染而轉(zhuǎn)化。在培養(yǎng)時,bEnd.3細(xì)胞最常遇到的問題就是細(xì)胞形態(tài)變化和難消化,本期細(xì)胞學(xué)堂將幫您逐一解決。




細(xì)胞形態(tài)問題




bEnd.3細(xì)胞本身生長較慢,在低密度時會呈現(xiàn)不規(guī)則細(xì)胞形態(tài),高密度時則呈規(guī)則纖維狀,所以若在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)異常,則有可能是細(xì)胞密度低,建議細(xì)胞鋪滿密度較高時傳代。以下為bEnd.3細(xì)胞不同密度培養(yǎng)圖片:


圖片

低密度(100倍鏡)


圖片

中密度(100倍鏡)


圖片

高密度(100倍鏡)





消化問題




消化時間

bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)時間越長越難消化,培養(yǎng)4天傳代,一般消化3-5分鐘;培養(yǎng)7天傳代,一般消化5-10分鐘。具體消化時間以顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)為準(zhǔn)。


圖片

培養(yǎng)7天,消化5分鐘顯微圖


圖片

培養(yǎng)7天,消化10分鐘顯微圖




難消化問題

如遇到消化困難不必?fù)?dān)心,可通過分次消化的方式解決,具體操作方法如下(以T25瓶細(xì)胞為例):

01

吸出原培養(yǎng)液;

02

加入2mL左右PBS,輕輕晃動培養(yǎng)瓶潤洗細(xì)胞,吸出PBS丟棄;

03

加入1mL左右胰酶,輕輕晃動培養(yǎng)瓶使之浸潤所有細(xì)胞;

04

放入培養(yǎng)箱消化,消化3-5分鐘(根據(jù)具體細(xì)胞稍作延長或縮短),顯微鏡下看到細(xì)胞開始漂浮,可以加入2mLPBS,晃動培養(yǎng)瓶使細(xì)胞懸浮,不要吹打剩下的貼壁細(xì)胞;

05

吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)的PBS和細(xì)胞懸液,轉(zhuǎn)移到無菌離心管中,在離心管中加入3mL含血清的培養(yǎng)基終止消化并吹散細(xì)胞,使細(xì)胞盡量呈單顆細(xì)胞的懸浮液;

06

原培養(yǎng)瓶中加入0.5mL胰酶,晃動培養(yǎng)瓶浸潤細(xì)胞,放入培養(yǎng)箱繼續(xù)消化,直到細(xì)胞塊中間全部收縮變圓,晃動培養(yǎng)瓶可脫落;

07

用3mL含血清的培養(yǎng)基終止消化,將瓶底的細(xì)胞全部吹下,并輕輕吹吸分散細(xì)胞呈單顆;

08

收集細(xì)胞懸液與第一次消化下來的細(xì)胞合并到一個離心管;

09

離心收集細(xì)胞沉淀,1200rpm/min 3分鐘,離心完吸出上清丟棄;

10

加入新鮮培養(yǎng)基,吹打幾下混勻細(xì)胞,按需接種到新培養(yǎng)瓶,補(bǔ)足培養(yǎng)基,擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進(jìn)行培養(yǎng);

11

檢查培養(yǎng)箱二氧化碳,溫度和水盤。





培養(yǎng)小貼士





01

圖片


細(xì)胞培養(yǎng)過程中形態(tài)多樣,低密度時容易出現(xiàn)放射狀細(xì)胞,看似已經(jīng)鋪滿瓶底,其實細(xì)胞量較少,需要細(xì)胞胞體排列緊密的時候進(jìn)行傳代;

02

圖片


細(xì)胞培養(yǎng)過程中避免頻繁換液,可以每隔2-3天換液或者半量換液一次;

03

圖片


培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生10%左右活的單顆漂浮細(xì)胞,貼壁細(xì)胞密度偏低時,注意收集懸浮細(xì)胞,貼壁細(xì)胞密度偏高時,可以換液時丟棄;

04

圖片


接種量對細(xì)胞生長有影響,接種量過低細(xì)胞會有增殖緩慢,漂浮過多的現(xiàn)象,請注意控制傳代比例;

05

圖片


細(xì)胞對溫度和pH較敏感,傳代或換液前培養(yǎng)基可以常溫復(fù)溫4小時以上;避免使用pH改變(偏酸:顏色偏黃;偏堿:顏色偏紫紅)的培養(yǎng)基;

06

圖片


細(xì)胞傳代過程中若出現(xiàn)單次消化時間過長,可進(jìn)行分次消化,切不可將細(xì)胞強(qiáng)行吹下來,以避免吹打造成細(xì)胞機(jī)械損傷。




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