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直播答疑 | 原代細(xì)胞培養(yǎng)常見問題及解決方案

更新時(shí)間:2023-11-14  |  點(diǎn)擊率:914

原代培養(yǎng)是指由體內(nèi)取出組織或細(xì)胞進(jìn)行的首-次培養(yǎng),也叫初代培養(yǎng),是細(xì)胞系建立的第一步。

在9月22日開播的“原代細(xì)胞常見問題解決方案"課程中,有很多老師就原代細(xì)胞培養(yǎng)問題提出了疑問。我們篩選出部分代表性問題,并作了詳細(xì)解答。


臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞需要包被嗎?選用什么包被比較好?

臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞建議包被,建議選用0.1%明膠包被,包被的細(xì)胞形態(tài)會(huì)比不包被的好看。


角質(zhì)細(xì)胞需要包被嗎?

角質(zhì)細(xì)胞生長類似上皮細(xì)胞,營養(yǎng)環(huán)境要求高,建議使用膠原蛋白包被。


細(xì)胞原皿狀態(tài)很好,傳代后細(xì)胞邊界不清楚是什么原因?感覺虛化的很快。

傳代后邊界不清晰,考慮細(xì)胞是否需要外基質(zhì)條件,嘗試包被培養(yǎng)瓶;其次考慮細(xì)胞是否老化、分化。


請(qǐng)問真菌污染了怎么辦?就丟了這瓶細(xì)胞嗎?

真菌污染細(xì)胞,建議丟棄,避免對(duì)其他細(xì)胞造成交叉污染,損失更大;若要挽救,建議隔離培養(yǎng),加兩性-霉素B等抗生素,每天換液,持續(xù)清除,但只能維持幾周,后續(xù)培養(yǎng)會(huì)反復(fù)爆發(fā),耗費(fèi)成本更高。


支原體污染會(huì)改變細(xì)胞的形狀嗎?細(xì)胞里面也有很多小碎片,這該怎么辦?用抗支原體藥可以去除細(xì)胞外碎片,但是細(xì)胞里的無變化。

污染較輕的,不會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài),出現(xiàn)大量碎片,細(xì)胞內(nèi)部也有碎片,污染就很嚴(yán)重了,支原體清除試劑對(duì)外部清除有效,內(nèi)部較難清除;同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)部已損傷情況下,沒有必要清除,此時(shí)細(xì)胞已經(jīng)喪失很多功能,建議廢棄。


肝細(xì)胞培養(yǎng)中包被對(duì)其影響大嗎?

肝細(xì)胞營養(yǎng)環(huán)境要求較高,建議包被,不包被影響貼壁率(低于50%),長時(shí)間培養(yǎng)不包被會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞卷曲聚團(tuán),影響狀態(tài)。


原代人牙周膜細(xì)胞凍存復(fù)蘇后貼壁很少且生長很慢,怎么處理呢?

原代細(xì)胞復(fù)蘇貼壁少,生長慢,首先是調(diào)整細(xì)胞密度保持在70%以上,確保生長狀態(tài),其次選用高質(zhì)量血清或培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)救,也可以補(bǔ)加5%血清。


小鼠原代雪旺細(xì)胞傳代后不增殖怎么辦?

一般建議:

1

靜置培養(yǎng)細(xì)胞,細(xì)胞在穩(wěn)定環(huán)境下更易生長,一般3-5天可有變化;

2

調(diào)整細(xì)胞密度,控制在70%-80%,更利于細(xì)胞生長;

3

補(bǔ)加適量血清促進(jìn)細(xì)胞增殖,或更換質(zhì)量更高的血清,提高營養(yǎng)因子促進(jìn)細(xì)胞生長。雪旺細(xì)胞分離初期1-2周是處于停止增殖狀態(tài)的,度過該時(shí)期才會(huì)增殖。


原代細(xì)胞的紅細(xì)胞較多怎么辦?需要紅細(xì)胞裂解液嗎?

分離初期紅細(xì)胞較多,可用淋巴細(xì)胞分離液或Percoll分離液分離,也可用裂解液處理。


原代分離肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,酶消化法和貼壁法,哪個(gè)更好呢?

貼壁法細(xì)胞爬出慢,周期長,成功率不高耗費(fèi)時(shí)間,得到的細(xì)胞活性相對(duì)高;消化法,速度快,數(shù)量多,剛分離的活性差一點(diǎn),后期培養(yǎng)要適應(yīng),看自主需求選擇。


干細(xì)胞傳代次數(shù)有限制嗎?

理論上無傳代次數(shù)限制,實(shí)際培養(yǎng)中,受離體培養(yǎng)環(huán)境變化、血清質(zhì)量、培養(yǎng)基質(zhì)量、傳代損傷等外部培養(yǎng)環(huán)境影響,細(xì)胞超過10代以上會(huì)出現(xiàn)分化、不增殖、老化凋亡等問題,所以常規(guī)建議10代以內(nèi)使用。


我們?nèi)〉墓趋兰⌒l(wèi)星細(xì)胞,在大皿養(yǎng)沒事,一換液就漂,是啥原因?

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,本身貼壁性不強(qiáng),易漂浮,特別是局部密度大會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞聚集成束,最后分化形成肌管束,建議培養(yǎng)中均勻接種,包被增強(qiáng)吸附性,控制密度在70-80%。


脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)分離細(xì)胞時(shí),沒有細(xì)胞怎么辦?

脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)沒分出細(xì)胞,一是要檢查分離方法是否正確,中間每一步操作最好進(jìn)行鏡檢,可以找出是哪一步損失細(xì)胞的,二是考慮后面離心步驟是否損失細(xì)胞,細(xì)胞包含脂滴,密度較小,漂浮丟棄了也有可能。



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